粒曼专注于提供细胞体外基因敲除解决方案，针对细胞基因敲除的定制服务。至今，我们已提供多种细分的敲除服务，欢迎咨询粒曼团队，获取更详细的技术路线及成功案例资料。

粒曼提供真核细胞的体外基因敲除定制服务，我们的团队将定期更新Q&A，以更好地满足客户需求。当前版本的Q&A包含以下问题：

基因敲除服务相关问答

前1-20问，关于基因敲除定制服务的常见问题，具体请参考服务指南| 粒曼高通量基因敲除定制服务（RNP法）

关键问题解析

• 21. 如何验证基因敲除是否成功？
• 22. 精准敲除与模糊敲除的区别？

（1）精准敲除是通过同源重组（HDR，Homology-Directed Repair）在目标基因中引入特定修饰（如片段删除、点突变或插入），实现在基因功能上完全或部分失活。这种方式的实验策略明显区别于传统基因敲除，一般所称的基因敲除往往是模糊敲除。粒曼提供精准敲除定制服务，专注于对靶基因指定区域的精准核苷酸序列进行敲除、敲入及突变等操作。

（2）模糊敲除则是通过非同源末端连接（NHEJ，Non-Homologous End Joining）机制，在目标基因的特定区域随机引入插入或缺失（Indel）突变，从而导致基因编码框移位或提前终止密码子，最终破坏基因功能。

23. CRISPR/Cas9方法可以敲除的最大片段范围大概有多少？理论上，它能够敲除1kb到1Mb范围的片段，结合多靶点切割技术或其他方法（如CRISPRa/i、表观遗传修饰），可以实现超大片段的敲除（1Mb）。

24. 如何提高原代细胞的编辑效率？可以使用病毒载体如慢病毒/AAV整合至基因组，采用电场诱导细胞膜穿孔的方式贴壁或悬浮原代细胞（需优化参数），直接将Cas9-RNP导入核内；此外，难以转染的细胞（如原代T细胞）可使用脂质纳米颗粒包裹Cas9-sgRNA复合物。

25. 如何提高基因敲除效率？

26. 如何分析基因敲除后的表型变化？

27. 如何区分纯合敲除与杂合敲除？

28. CRISPR RNP法适合于哪些细胞及场景？

总结

CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法通过将多条针对靶基因的单导RNA（sgRNA）与Cas9蛋白体外混合，形成核糖核蛋白复合物RNP。通过电转化或脂质体转染的方式，将RNP有效递送到细胞内，可获得高效且稳定遗传的细胞池（即稳转细胞多克隆），无需传统慢病毒或质粒的方法。

RNP在细胞内完成基因组编辑后会被迅速降解，避免外源序列的引入，从而尽可能保持细胞的表型，这是当前降低脱靶效应的最佳方法。它有效避免了病毒基因组的随机整合，从而影响后续功能性实验，同时避免传统方法中Cas9和sgRNA的持续表达导致的基因组不稳定性及高脱靶风险。使用CRISPR/Cas9 RNP法进行基因敲除细胞系的构建已经在进行中，将完全替代传统方法。

如需了解更多信息，请随时联系粒曼团队以获取有关俄罗斯专享会294的详细咨询。